Insegnamento METODOLOGIE BIOCHIMICHE
| Nome del corso di laurea | Biologia |
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| Codice insegnamento | GP004082 |
| Curriculum | Bionutrizionistico |
| Docente responsabile | Elisabetta Chiaradia |
| Docenti |
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| Ore |
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| CFU | 6 |
| Regolamento | Coorte 2018 |
| Erogato | Erogato nel 2018/19 |
| Erogato altro regolamento | Informazioni sull'attività didattica |
| Attività | Affine/integrativa |
| Ambito | Attività formative affini o integrative |
| Settore | BIO/10 |
| Anno | 1 |
| Periodo | Primo Semestre |
| Tipo insegnamento | Opzionale (Optional) |
| Tipo attività | Attività formativa monodisciplinare |
| Lingua insegnamento | Italiano |
| Contenuti | fasi di un progetto di ricerca. Parametri di qualità del metodo. Tecniche di estrazione di macromolecole da tessuti, Tecniche centrifugative, Tecniche spettroscopiche-Tecniche elettroforetiche.Techiche di Blotting.Tecniche cromatografiche. Proteomica. Analisi enzimatica . Metodi di purificazione proteica .Estrazione acidi nucleici. lezioni pratiche in laboratorio: Dosaggio delle proteine secondo Bradford. Praparazione di una retta di calibrazione e suo utilizzo. Western Blotting Elettroforesi bidimensionale e colorazione del gel |
| Testi di riferimento | Keith Wilson and John Walker: Biochimica e biologia molecolare:Principi e tecniche EDs. 2006 Raffaello Cortina Editore. ISBN 88-6030-066-5 oppure Bonaccorsi, Contestabile, Di Salvo -Metodologie biochimiche-Casa Editrice Ambrosiana. Distrib. Zanichell |
| Obiettivi formativi | L'obiettivo principale dell'insegnamento consiste nel fornire agli studenti le basi per affrontare lo studio dei principi teorico-pratico di specifiche metodiche biochimiche per la caratterizzazione delle biomolecole e l'analisi di vie metaboliche. Le principali conoscenze acquisite saranno: Elementi di base per l'applicazione delle principali metodiche utilizzate in un laboratorio di biochimica: tecniche di omogeneizzazione, centrifugative, cromatografiche, elettroforetiche; spettroscopiche; enzimatiche. spettrometria id massa, etc. Elementi di base per la scelta delle metodiche da applicare allo specifiche esigenze sperimentali. Lo studente dovrà inoltre acquisire le capacità critiche per la valutazione del risultato e una discrta manualità nell'utilizzo dell astrumentazione di un laboratori di biochimica. |
| Prerequisiti | Al fine di compredere e saper applicare le tecniche descritte nel corso è necessario aver sostenuto con successo l'esame di chimica generale e inorganica, di chimica organica e l'esame di biochimica. E' importante inoltre che lo studente sia in grado di risolvere semplici esercizi di stechiometria. |
| Metodi didattici | In corso è organizzato nel seguente modo Lezioni frontali in aula su tutti gli argomenti del programma Esercitazioni pratiche in laboratorio |
| Modalità di verifica dell'apprendimento | L'esame prevede una prova orale individuale della durata di circa 30 minuti finalizzata and accertare il livello di conoscenza e la capacità di comprensione raggiunto dallo studente sui contenuti teorici e metodologici degli argomenti trattati e indicati nel programma. In particolare, lo studente dovrà dimostare di conoscere i principi torici di base di specifiche metodiche biochimiche ( es cromatografia, elettrofresi, spettrometria di massa, dosaggi enzimatici, etc.....) e le loro protenzialità applicative nell'esecuzione di un protocollo sperimentale volto allo studio delle proprieta chimico fisiche delle mocromolecole biologiche e delle vie metaboliche in cui esse sono coinvolte. Per informazioni sui servizi di supporto agli studenti con disabilità e/o DSA visita la pagina http://www.unipg.it/disabilita-e-dsa |
| Programma esteso | Introduzione al corso- fasi di un progetto di ricerca. Come si progetta un esperimento. Cenni su metodo scientifico. Parametri di qualità del metodo: errore totale e attendibilità, l’accuratezza, la precisione la sensibilità, la specificità, la ripetibilità ,riproducibilità. I possibili approcci sperimentali: classico e "omics" (2 ore). Tecniche di estrazione di macromolecole da tessuti, cellule, fluidi biologici- Importanza e contenuti dei principali tamponi di estrazione. Preparazione di un tampone di estrazione. Metodi di rottura delle cellule: Omogenizzazione, French Press, sonicazione, metodi enzimatici e con l’uso di abrasivi. Principi di estrazione e coefficiente di ripartizione ed estrazione liquido, precipitazione frazionata. Dialisi e filtrazione. (3 ore). Tecniche centrifugative: Principi di base della sedimentazione, tipi di rotori, tipi di centrifughe. Tecniche di sedimentazione differenziale, in gradiente di densita’, isopicnica. (2 ore). Tecniche spettroscopiche-, spettroscopie di emissione e di assorbimento, assorbanza e trasmittanza, spettrofotometria UV/visibile, transizioni elettroniche, caratteristiche dei cromofori, legge di Lambert-Beer, lo spettrofotometro applicazioni della spettrofotometria UV/visibile, Rette di tarature per analisi quantitative. Metodi per il dosaggio delle proteine: bradford, biureto, BCA, Lowry. Principi della spettroscopia di fluorescenza, alcune applicazioni in biochimica. lo spettrofluorimetro, Fosforescenza (cenni)- (4 ore). Tecniche elettroforetiche: Principi generali. Elettroforesi su Gel di agarosio e poliacrilammide (PAGE) e criteri di utilizzo. Elettroforesi orizzontale e verticale Elettroforesi su SDS-PAGE ed elettroforesi in condizioni native. Colorazione dei gel: Comassie brilliant Blue, Silver staining, colorandi fluorescenti e criteri di utilizzo; bromuro di etidio. (4 ore). Techiche di Blotting: principi generali, cenni di Southern e Northern Blotting., Wester Blotting: trasferimento, Rivelazione delle proteine: tramite colorazione su membrana (Ponceau S) o con anticorpi coniugati ad enzimi. Immunoblotting: le diverse fasi (2 ore). Proteomica: principi generali, approccio gel based e gel free. Elettroforesi bidimensionale: Preparazione del campione, isolettrofocalizzazione, equilibrazione, SDS Page. Colorazione dei gel. Techica DIGE. Analisi densitometrica differenziale dei gel. Spettrometria di massa e fingerprinting proteico: MALDI-TOF, and ESI-. Analisi in banca dati per l'identificazione della proteina (6 ore). Tecniche cromatografiche- Caratteristiche generali delle separazioni cromatografiche,Cromatografia planare e su colonna. Piatti teorici, capacità efficienza e selettività . Cromatografia di adsorbimento, Cromatografia d’esclusione molecolare, Cromatografia a scambio ionico, cromatografia d’affinità. HPLC caratteristiche e sue applicazioni e rivelatori. GLC caratteristiche e sue applicazioni, rivelari FID e ECD. Lettura e interpretazione di un cromatogramma. Utilizzo di standard interno (6,5 ore). Analisi enzimatica - Cenni di cinetica enzimatica, Misura di attività enzimatica, (Kat., UI), preparazione ed esecuzione di un dosaggio enzimatico. Determinazione della concentrazione di una enzima, della concentrazione del substrato, della km e del tipo di inibizione. Dosaggi spettrofotometrici semplici e mediante reazioni accoppiate,, dosaggi spetrofluorimetrici e in luminescenza. Isoenzimi (LDH) (3,5 ore). Estrazione acidi nucleici. concetto di resa e purezza. Possibili applicazione delle metodiceh fin ora analizzate per le diverse strategie di purificazione. utilizzo dei Kit commerciali di estrazione. Valutazione della qualità e quantità dell’estratto. (2 ore). |